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食品的三大機(jī)能： 營養(yǎng)學(xué)特性、 嗜好性感官品質(zhì)特征、 對人體的調(diào)節(jié)技能 或保健機(jī)能。茶葉是為數(shù)不多的同時具備這三大機(jī)能要求的食品。茶不 僅能夠帶給人們味覺的享受，還能夠促進(jìn)人們的身體健康，種種好處使得茶 受到越來越多人的歡迎。飲茶、 品茶已經(jīng)成為人們生活中*的一部分。 隨著茶葉風(fēng)靡，越來越多人開始重視茶葉的質(zhì)量和安全問題。但是在茶 葉的生長過程中，為 了 殺蟲除菌、提高增產(chǎn)率，不可避免的會使用到農(nóng)藥，農(nóng) 藥會殘留在茶葉上極難清除， 也不可避免的會對環(huán)境和人類健康產(chǎn)生危害或 者有潛在的威脅。有資料顯示，中國的茶樹除了有機(jī)茶被限制不能噴灑農(nóng)藥， 99%的茶樹都或多或少的噴撒了農(nóng)藥?，F(xiàn)在世界上有近30億人飲用茶，世界 各地都有種植茶葉和茶葉進(jìn)出口貿(mào)易，在如此大的需求面前，許多國家制定 的農(nóng)藥殘留相關(guān)法規(guī)并沒有那么完善，大部分國家只標(biāo)明了茶葉中農(nóng)藥殘留 的大標(biāo)準(zhǔn)，而并不是禁止農(nóng)藥殘留的存在。同時各個國家對茶葉的農(nóng)藥殘 留相關(guān)的法律法規(guī)也不統(tǒng)一， 例如，歐洲因為地域氣候關(guān)系不適合種植茶葉， 同時對食品的安全衛(wèi)生要求更高，因此它對茶葉農(nóng)藥殘留的標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格，
而 中國的產(chǎn)茶量和出口量，但 由 于國外貿(mào)易壁壘日趨嚴(yán)格，導(dǎo)致了 中國茶葉的出口量減少[1]，主要原因是因為中國關(guān)于茶葉農(nóng)藥殘留量的指標(biāo) 還未完善[2]。這幾年茶葉農(nóng)殘相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)不斷更新出臺，可 見 茶葉中農(nóng)藥殘 留問題越來越受到重視[3]。 近五年，歐盟對茶葉相關(guān)法規(guī)進(jìn)行了多達(dá)69次修訂，茶葉農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)限制 對象已經(jīng)從茶園中使用的一般農(nóng)藥擴(kuò)展到草甘膦等除草劑，再到蒽醌、多氯 酸鹽等環(huán)境污染物。近出口歐盟的茶葉中又查出鄰苯基苯酚這一防腐殺菌 劑，鄰苯基苯酚是一種能夠致癌的物質(zhì)，對 腎臟會產(chǎn)生毒副作用， 危害人體健 康，因此迫切需要建立一種， 快捷的方法來測定茶葉中鄰苯基苯酚。鄰苯 基苯酚， 又叫做2-羥基聯(lián)苯(ortho-phenylpheno，簡稱OPP)，一 般 為 白 色 片 狀 或 塊 狀，具有一定生物毒性。鄰苯基苯酚具備良好的殺菌殺毒能力，是 常 用 的 防 腐 劑 之 一，一 般 都用在對果蔬類的防腐和保鮮，或者是用于紡織品、橡膠制 品、 化妝品等當(dāng)中的消毒劑和防腐劑。目前， OPP殘留檢測的主要方法有液相 色譜法[4-7]、氣相色譜法或氣相色譜-質(zhì)譜法[8-10]。色譜法分析成本高， 色譜儀價 格及日常維護(hù)費用貴， 分析時間一般比較長。而紫外檢測器是普遍的檢測 途徑，大部分物質(zhì)在液體狀態(tài)下都有紫外檢測光譜，其 吸光值和其濃度呈現(xiàn) 一定的線性關(guān)系，且不同的物質(zhì)的紫外峰基本都是峰，并且紫外分光光 光度法適合大眾能夠做到的檢測方法，它還擁有分析成本低、紫外檢測儀價 格及日常維護(hù)費用低、 準(zhǔn)確度高、 使用方便等優(yōu)點。 茶葉中因含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)和化合物，增加了茶葉前處理的難度。而 茶葉的前處理是整個分析過程的重要步驟，快速的提取方法更是茶葉中 農(nóng)藥殘留分析的核心，直接影響后期檢測方法的準(zhǔn)確度。因此農(nóng)藥殘留分析 茶葉的前處理要求提取率高， 盡量少用或不用有機(jī)溶劑[11]，以 減 少 污染。常見 的樣品前處理方法主要有干法灰化法、固相萃取法、 超聲波提取法等[12-14]，通 過查閱文獻(xiàn)[15-20]，本實驗采用超聲波萃取法作為茶葉的前處理方法。超聲波提 取法是利用超聲波強(qiáng)化提取作用，即媒質(zhì)產(chǎn)生*的機(jī)械振動作用和空化作 用， 機(jī)械振動作用將超聲波的能量傳遞給樣品，使組分脫附和溶解加快；空化 作用使分子運動加快[21]。超聲波提取法操作簡單，并且它擁有操作簡便、 提取 效率高，可 克服常規(guī)方法的被測成分在多次轉(zhuǎn)移中損失，從而影響檢測準(zhǔn)確 性的缺點。近年來超聲波提取法在茶葉的前處理中有著廣泛應(yīng)用[19-21]。 本文將專門講述先用甲醇：水，甲醇，乙醇溶液分別為提取試劑，并采用超聲波萃取來提取茶葉中的鄰苯基苯酚，結(jié)合紫外分光光度計分析在不同緩 沖液中，不 同 pH值下鄰苯基苯酚的大吸收峰并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 通過計算加 標(biāo)回收率確定方法的準(zhǔn)確性。從而建立了一種快速簡便地檢測茶葉中鄰苯基 苯酚含量的方法。 1 實驗部分 1.1 實驗試劑與儀器 1.1.1 試劑 2-苯基苯酚，Rd，NanqiaoTwon， FengxianShanghai， China；甲醇，AR，國 藥 集 團(tuán) 化 學(xué) 試 劑 有 限 公司；乙醇，AR，國 藥 集 團(tuán) 化 學(xué) 試 劑 有 限 公司； 茶葉，西湖龍 井，浙江省杭州市 1.1.2 儀器設(shè)備 紫外可見分光光度計，UV1901PC紫外可見分光光度計；電子天平， ML104/02，；超聲波清洗器，2 結(jié)果與討論 2.1 溶劑（萃取劑）的選擇 鄰苯基苯酚微溶于水，因此選擇了三種不同極性的溶劑[22-23]（甲醇：水，甲 醇，乙醇）來進(jìn)行比較選出溶劑。 稱取鄰苯基苯酚，在其他制備條件保持不變的前提下，使用三種不同溶 劑：甲醇： 水（7:3）、甲醇、乙醇分別配制6滋g/mL，分別以不同溶劑作為空白進(jìn) 行基線的確定，在 190耀400nm波長范圍內(nèi)多次進(jìn)行光譜的連續(xù)掃描，并作出 紫外峰來進(jìn)行比較。可 知 甲醇： 水（7:3）紫外吸收峰，并采用其作為溶液的 溶劑（萃取劑）。實驗結(jié)果可知，甲醇： 水（7:3），甲醇，乙醇三種萃取劑的標(biāo)準(zhǔn)溶 劑吸收曲線峰形一致，在其他條件不變的是情況下，甲醇：水（7:3）溶劑的紫外 峰大吸收波長處的吸光值， 更故采用甲醇： 水（7:3）作為樣品的萃取劑。 2.2 OPP紫外檢測方法優(yōu)化 2.2.1 OPP大吸收波長的選擇 吸取2滋g/mL的OPP溶液于比色皿中，以 甲醇：水（7:3）溶劑作為空白進(jìn) 行基線的確定，在190耀400nm波長范圍內(nèi)多次進(jìn)行光譜的連續(xù)掃描，如圖 （1），以 確 定 OPP的大吸收波長。圖（1） 大吸收波長的確定 由圖（1）可知，鄰苯基苯酚在190耀400nm 范圍內(nèi)，在 201.0、283.5nm波 長處均有吸收峰，其中以201.0nm處的吸收峰，無雜峰干擾且較為穩(wěn)定， 適合作為大吸收波長進(jìn)行實驗。 2.2.2 OPP適宜緩沖液的選擇 在三組6滋g/mL的OPP溶液分別加入pH=8.5的不同的緩沖液（BR緩沖 液， PBS緩沖液，醋酸緩沖液），分別加入于比色皿中，以 甲醇：水（7:3）溶劑作 為空白進(jìn)行基線的確定，在其他制備條件保持不變的前提下，在 190耀400nm 波長范圍內(nèi)多次進(jìn)行光譜的連續(xù)掃描， 通過其紫外峰的大吸收峰來確定 適宜的緩沖液。實驗結(jié)果可知， 三種不同緩沖液（BR緩沖液， PBS緩沖液， 醋酸 緩沖液）對于OPP 標(biāo)準(zhǔn)液的影響的不同程度，其中醋酸緩沖液所得吸光值 大，但因其大吸收波長處也導(dǎo)致偏離，故選用BR緩沖液作為OPP溶液的 適宜緩沖液。 2.2.3 OPP適宜緩沖液pH值的選擇 通過查閱文獻(xiàn)可知[24]，在 酸 性 條件下,pH對OPP的紫外吸收影響不大， 故 在6滋g/mL的OPP溶液中加入pH值為6.5、 7、 7.5、 8、 8.5、 9、 9.5、 10的BR緩沖 液， 并測其大吸收峰。根據(jù)不同pH值測得的吸光度繪制pH值與吸光度的 變化關(guān)系。得出6滋g/mLOPP標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同pH值下BR緩沖液的吸光值， 可知OPP標(biāo)準(zhǔn)溶液在pH=7.5下的吸光值。 2.3 OPP標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 從上述OPP儲備液（200.0滋g/mL）標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸取 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、1mL定容于 10mL容量瓶，配制 2、 4、 6、 8、10、 12、 20滋g/mL質(zhì)量濃度 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。從2滋g/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸取5mL 定容于 10mL 容量瓶中配制 1滋g/mL溶液。從20滋g/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸取0.1、 0.25、 0.75mL定容至 10mL容 量瓶中配制0.2、 0.5、 1.5滋g/mL溶液。從1滋g/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸取0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1、 1.2mL 定容至 10mL 容量瓶中配制 0.02、 0.04、 0.06、 0.08、 0.10、 0.12滋g/ mL溶液。標(biāo)準(zhǔn)溶液均用甲醇： 水（7:3）定容，采用緩沖液的pH值， 并在 大吸收波長處進(jìn)行紫外掃描得出 OPP 標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算出線性相關(guān)系方程如 圖（2）。
測定不同濃度鄰苯基苯酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液在大吸收波長處的吸光值，繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線（2），可 知 鄰苯基苯酚濃度與吸光度沒有呈直線關(guān)系，通過分析， 取lgC為橫坐標(biāo)， A為縱坐標(biāo)，并擬合得到回歸方程： y=0.3x+1.505，線性相 關(guān)系數(shù)為0.994。由（2）可以看出當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度在0.02耀12滋g/mL范圍 內(nèi)，鄰苯基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好。說明使用該曲線測定待測樣品的 鄰苯基苯酚含量具有較高的準(zhǔn)確性。 2.4 樣品的預(yù)處理與測定 2.4.1 樣品的預(yù)處理 稱取0.1g茶葉樣品，碾碎于離心瓶中加入甲醇： 水（7： 3）萃取劑10mL，在 超聲波清洗器中超聲提取20分鐘，將萃取劑倒出在10mL燒杯中備用。 2.4.2 樣品的測定和樣品加標(biāo)回收率的測定 提取超聲后的萃取劑0.1mL稀釋至10mL,加入BR緩沖液，以 甲醇：水 （7:3）溶劑作為空白進(jìn)行基線的確定，作出樣品的紫外峰與OPP標(biāo)準(zhǔn)溶液的 紫外峰圖進(jìn)行比較。 量取上述稀釋后樣品溶液均勻液體試樣5mL， 裝入比色皿中在大波長 處進(jìn)行紫外掃描， 確定空白樣品中OPP的含量。然后分別量取3份均勻液體 試樣5mL，加入5mL質(zhì)量濃度為 0.5、 2、 8滋g/mL的OPP溶液。以甲醇： 水（7: 3）溶劑作為空白進(jìn)行基線的確定， 采用緩沖液的PH值，在 大波長處進(jìn) 行紫外掃描。每組回收率測定 3次，取平均值進(jìn)行計算，計算結(jié)果如表1所 示， 由此可見，其 加 標(biāo) 回 收 率 范圍在90.1%耀91.2%， 回收率在正常范圍內(nèi)，符合 加標(biāo)回收率的標(biāo)準(zhǔn)， 證明方法是可行的。 為確定茶葉中是否有其他物質(zhì)干擾影響實驗結(jié)果的測定， 分別配制兒茶 素、維生素C6滋 g/mL，取1mL裝入比色皿中， 作出三種物質(zhì)的紫外吸 收峰，和 OPP標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外峰圖進(jìn)行比較，觀察是否對大波長處的吸收 峰有影響。實驗證明上述物質(zhì)對該檢測方法均無干擾。 3 總結(jié) 本實驗建立了茶葉中的鄰苯基苯酚含量的測定方法，具有準(zhǔn)確性和穩(wěn)定 性。利用甲醇:水（7:3）作為萃取劑，萃取方法選擇超聲波萃取法， 萃取出茶葉 中的鄰苯基苯酚，并采用紫外分光光度法，建立鄰苯基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線對其進(jìn) 行含量測定，對 標(biāo)準(zhǔn)曲線的萃取劑， 緩沖液， 適宜pH值等條件進(jìn)行優(yōu)化。在 在 0.02耀12滋g/mL范圍內(nèi)，鄰苯基苯酚濃度與吸光度具有良好線性關(guān)系，其 相 關(guān) 系 數(shù) 為 0.994，加標(biāo)回收率在90.1%耀91.2%之間，符合加標(biāo)回收率的標(biāo)準(zhǔn)，證 明方法是可行的。結(jié)論為通過超聲波萃取結(jié)合紫外分光光度法能夠測定茶葉 中鄰苯基苯酚，并且該方法具有準(zhǔn)確度高，反應(yīng)靈敏， 操作簡便等優(yōu)點